無(wú)需厭氧培養條件即可檢測環(huán)境中艱難梭菌分離株的選擇性培養基

受污染的環(huán)境表面是艱難梭菌傳播的一個(gè)重要來(lái)源。許多研究表明，醫療機構的環(huán)境消毒效果往往不盡如人意。對檢測孢子污染有效且簡(jiǎn)單易操作的方法，將有助于通過(guò)識別環(huán)境污染，并提供一種監測消毒效果的手段，從而為改善環(huán)境消毒做出相應干預措施。商用 PCR 檢測方法易于使用且廣泛可用，但其靈敏度可能不足以檢測低水平的環(huán)境污染。傳統培養基的檢測方法對檢測艱難梭菌很敏感，但由于對厭氧培養條件和微生物學(xué)專(zhuān)業(yè)知識的要求較高，其實(shí)用性大打折扣。選擇性厭氧肉湯培養預擴增毒素基因實(shí)時(shí)PCR檢測為檢測無(wú)癥狀艱難梭菌污染物提供了一種敏感的方法，這種方法可用于環(huán)境污染的檢測，但其局限性包括需要厭氧培養條件和PCR檢測的費用。

本研究的目標是開(kāi)發(fā)一種廉價(jià)且易于使用的有效的檢測方法。因此推薦這篇文章給大家，希望能對大家有所幫助。

Sensitive and Selective Culture Medium for Detection of Environmental Clostridium difficile Isolates without Requirement for Anaerobic Culture Conditions

內容

摘要：有效且易于使用的檢測艱難梭菌孢子污染的方法將有助于確定環(huán)境蓄水池和監測室內消毒的效果?；谂囵B基的檢測方法對檢測艱難梭菌很敏感，但由于需要厭氧培養條件和微生物檢驗，其實(shí)用性受到限制。作者改良了一種含有硫代乙醇酸和L-胱氨酸的低成本選擇性肉湯培養基，稱(chēng)為含硫代乙醇酸和L-胱氨酸的艱難梭菌布魯氏菌肉湯（CDBB-TC），用于檢測需氧培養條件下環(huán)境標本中的艱難梭菌。比較了 CDBB-TC（需氧培養條件下）和 CDBB（厭氧培養條件下）從病房表面采集的拭子中回收艱難梭菌的靈敏度和特異性。CDBB-TC 在回收環(huán)境艱難梭菌方面的靈敏度明顯高于 CDBB（分別為 36/41 [88%] vs 21/41 [51%]；P = 0.006）。艱難梭菌乳膠凝集試驗、毒素A和毒素B或谷氨酸脫氫酶酶聯(lián)免疫測定以及毒素B基因PCR檢測都是有效的確證試驗。在總共 477 份環(huán)境培養物中，根據培養基呈黃色（陽(yáng)性反應），但實(shí)際未發(fā)現艱難梭菌，CDBB-TC與CDBB的特異性分別為 100%（0個(gè)假陽(yáng)性結果）和 96%（18個(gè)假陽(yáng)性結果）。CDBB的假陽(yáng)性培養是由于在CDBB-TC 中不生長(cháng)的厭氧非艱難梭菌的生長(cháng)造成的。我們的結果表明，CDBB-TC 為從環(huán)境樣本中回收艱難梭菌提供了一種靈敏且具有選擇性的培養基，且無(wú)需厭氧培養條件。

結果與討論

艱難梭菌在CDBB與CDBB-TC中的萌發(fā)和生長(cháng)的區別：

    如圖1所示，CDBB-TC和CDBB的艱難梭菌孢子萌發(fā)和生長(cháng)的速率和程度相似（圖1）。根據對酒精的敏感性，大約90%的孢子（1 log）在30 min內萌發(fā)。

CDBB-TC和CDBB在實(shí)驗室的靈敏度和選擇性：

    從接種拭子中回收艱難梭菌孢CDBB-TC與CDBB相當（圖2）。CDBB-TC和CDBB在接種2 log10 CFU孢子的拭子中一致獲得陽(yáng)性結果。從接種1 log₁₀ CFU孢子的拭子中獲得陽(yáng)性結果；9次試驗中有3次（33%）CDBB陽(yáng)性，9次試驗中有7次（78%）CDBB-TC陽(yáng)性。CDBB陽(yáng)性培養在整個(gè)培養基管中呈黃色，而CDBB-TC陽(yáng)性培養在培養管底部呈

CDBB-TC與CDBB對從病房表面收集的拭子中回收艱難梭菌的敏感性和特異性：

總共從477個(gè)表面收集了環(huán)境拭子（345個(gè)來(lái)自CDI病房的表面，132個(gè)來(lái)自便攜式設備）。如圖3所示，41份樣品（9%）的CDBB-TC和CDBB培養物均呈陽(yáng)性：其中16例兩種培養基均為陽(yáng)性，20例僅CDBB-TC為陽(yáng)性，其中5例僅從CDBB中呈陽(yáng)性。對于一種培養基呈陰性而另一種培養基呈陽(yáng)性的環(huán)境樣本，用艱難梭菌乳膠凝集試驗對陰性樣品進(jìn)行驗證試驗，谷氨酸脫氫酶和毒素A和B的EIA，毒素B基因的PCR均為陰性。如果以所有艱難梭菌陽(yáng)性培養作為標準，CDBB-TC的敏感性明顯高于CDBB（36/41[88%]vs21/41[51%]；P=0.006），對于接受其他驗證性試驗的18份CDBB-TC培養陽(yáng)性標本，CDBB-TC管底部的18個(gè)（100%）等分經(jīng)其他確認試驗檢測為陽(yáng)性，包括艱難梭菌乳膠凝集，毒素B基因的PCR，以及谷氨酸脫氫酶和毒素A、B的EIA。對于8個(gè)培養陰性的CDBB試管和8個(gè)培養陰性的CDBB-TC試管，通過(guò)相同的驗證試驗，試管底部的肉湯均為陰性。

在477個(gè)環(huán)境培養中，基于沒(méi)有艱難梭菌的假陽(yáng)性黃色培養基的CDBB-TC和CDBB的特異性分別為100%（0個(gè)假陽(yáng)性結果）和96%（18個(gè)假陽(yáng)性結果）（P=0.0001）。18個(gè)CDBB假陽(yáng)性培養可歸因于非艱難梭菌厭氧生物的生長(cháng)，而它們沒(méi)有在CDBB-TC的有氧環(huán)境中生長(cháng)。

研究了不同pH值下硫代乙醇酸對艱難梭菌孢子萌發(fā)的影響：

    如圖4所示，艱難梭菌孢子在無(wú)菌水中或1 mg/ml硫乙醇酸且pH 5時(shí)最小萌發(fā)（基于1 mg/ml溶菌酶的孢子減少）（P≥0.82）；但是，在pH7.6，在80°C時(shí)，1 mg/ml硫乙醇酸（P＜0.0001）中孢子顯著(zhù)減少，溶菌酶沒(méi)有進(jìn)一步增強（P=0.74）。

討論：綜合研究報道及實(shí)驗結果表明：pH值為7.6而非pH值為5時(shí)，硫代乙醇酸可以刺激環(huán)境孢子恢復，溶菌酶提高艱難梭菌從環(huán)境樣品中的回收率。硫代乙醇酸可能使孢子對溶菌酶活性敏感，可能是通過(guò)破壞二硫鍵和增加溶菌酶對作用位點(diǎn)的滲透。

含有硫代乙醇酸和L-胱氨酸的肉湯培養基為環(huán)境標本提供了一種敏感和更具選擇性的培養方法，而不需要厭氧培養條件。這種培養基很容易制備，且價(jià)格相對便宜。此外，對微生物學(xué)專(zhuān)業(yè)知識的要求，因為基于顏色變化的陽(yáng)性肉湯樣品可以被確認為艱難梭菌。

多數厭氧生物在CDBB上生長(cháng)，并導致顏色變?yōu)辄S色。這些生物在有氧條件下培養的CDBB-TC中不生長(cháng)，但在厭氧條件下培養的CDBB-TC上生長(cháng)，這表明CDBB-TC比CDBB更具有選擇性。

本研究還具有一定的局限性。培養基是定性的，不能對污染負荷進(jìn)行評估。與海綿相比，拭子回收孢子的靈敏度可能會(huì )降低，并且環(huán)境樣本僅從一家機構采集，還需在多個(gè)機構額外進(jìn)行更大規模的研究。最后只測試了一種商用實(shí)時(shí) PCR 檢測方法，不同核擴增檢測方法的靈敏度可能存在差異。